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Principe de la coloration de Gram
La coloration de Gram, mise au point en 1884, s'effectue en trois temps. . Dans un premier temps, les bactéries sont colorées en violet par un colorant basique tel que le violet de gentiane puis par une solution de lugol (mordançage). . Dans un deuxième temps, qualifié de temps de différenciation, les bactéries sont soumises à l'action de l'alcool ou d'un mélange alcool + acétone. Les bactéries se répartissent en deux catégories : celles qui conservent la coloration violette et qui sont qualifiées de bactéries à Gram positif et celles qui sont décolorées et qui sont qualifiées de bactéries à Gram négatif. . Dans un troisième temps, afin de mieux visualiser les bactéries décolorées (bactéries à Gram négatif), on procède à un traitement par la fuchsine ou par la safranine. Les bactéries à Gram positif apparaissent alors violettes et les bactéries à Gram négatif se recolorent en rouge ou en orange.
. Lorsque des bactéries à Gram positif sont colorées par la méthode de Gram puis soumises au lysozyme, les protoplastes obtenus sont colorés en violet. Le siège de la coloration se situe donc au niveau du cytoplasme. Les protoplastes traités par l'alcool ou par un mélange alcool-acétone se décolorent instatanément.
Remarques : . La présence d'une épaisse couche de polysaccharides autour de la paroi peut faire apparaître comme Gram positive une bactérie dont la structure pariétale est typique d'une bactérie à Gram négatif. C'est le cas notamment de certaines espèces du genre Azospirillum. . Certaines bactéries dont la structure pariétale est typique d'une bactérie à Gram positif peuvent apparaître comme Gram négatif. C'est le cas par exemple de certaines souches de Butyrivibrio spp. dont la paroi est très fine. . Certaines bactéries dont la structure pariétale est typique d'une bactérie à Gram positif peuvent apparaître "Gram variable". Dans ce cas, la coloration de Gram effectuée sur une culture pure, montre un mélange de cellules à Gram positif et de cellules à Gram négatif. Ce phénomène est fréquemment observé avec des souches de Bacillus spp., notamment si la coloration est effectuée sur des cultures de plus de 18 heures. . Les mycobactéries sont typiquement des bactéries à Gram positif, mais elles ne prennent pas la coloration de Gram. . Les représentants de la classe des Mollicutes, bactéries dépourvues de paroi, se colorent comme des bactéries à Gram négatif. Il en va de même pour les formes L.
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