|
L'antibiogramme
Introduction
En 1942, Waksman a défini les antibiotiques comme des substances chimiques, produites par des micro-organismes et capables, à faible concentration, d'inhiber la croissance d'autres micro-organismes ou même de les détruire. Cette définition classique, permettant de différencier les antibiotiques des substances de synthèse dotées d'un pouvoir antibactérien, ne semble plus justifiée car de nombreuses substances, autrefois obtenues à partir de culture, sont actuellement synthétisées ou modifiées par synthèse.
Les antibiotiques utilisables en thérapeutique sont très nombreux et ils sont regroupés en familles selon leur structure chimique (voir tableau 1).
Chaque antibiotique est caractérisé par son spectre d'activité qui correspond aux différentes espèces bactériennes susceptibles d'être sensibles à son action. Selon les antibiotiques le spectre est limité ou large.
Le corollaire du spectre d'activité est la résistance naturelle des bactéries aux antibiotiques. Ainsi, les entérobactéries qui sont des bacilles à Gram négatif sont naturellement résistantes à la pénicilline G. La résistance naturelle est un caractère d'espèce, elle touche toutes les souches d'un espèce bactérienne donnée.
La connaissance du spectre d'activité des antibiotiques (et donc de la résistance naturelle des bactéries) devrait permettre d'instaurer un traitement. Dans la réalité, la situation est beaucoup plus complexe car les bactéries peuvent acquérir une résistance aux antibiotiques par modification de leur capital génétique (mutation, transformation, transduction, conjugaison). Cette résistance acquise préexiste à l'utilisation des antibiotiques mais l'utilisation intensive de ces molécules conduit à une sélection de nombreuses souches résistantes. Aussi, dans de nombreux cas, la seule identification de l'espèce bactérienne ne permet plus de prédire l'efficacité d'une antibiothérapie.
La notion de résistance est relative et, en pathologie infectieuse, on dit qu'une souche bactérienne est résistante à un antibiotique lorsqu'une modification de son capital génétique lui permet de tolérer une concentration d'antibiotique notablement plus élevée que la concentration qu'il est possible d'obtenir in vivo à la suite d'un traitement.
Dans le traitement d'une maladie bactérienne, il faut sélectionner l'antibiotique le plus efficace sur la bactérie pathogène et s'assurer que les concentrations atteignent un taux thérapeutique au sein du foyer infectieux. Le rôle du laboratoire de bactériologie est d'isoler et d'identifier les bactéries puis de déterminer in vitro, à l'aide de méthodes rigoureusement standardisées, l'activité des divers agents antimicrobiens.
Antibiogramme
Principe
L'antibiogramme a pour but de déterminer les Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) d'une souche bactérienne vis-à-vis des divers antibiotiques. Par définition (O.M.S.), la CMI est la plus faible concentration d'antibiotique capable de provoquer une inhibition complète de la croissance d'une bactérie donnée, appréciable à l'œil nu, après une période d'incubation donnée. La détermination de cette valeur est peu précise mais elle est consacrée par l'usage et elle bénéficie d'une masse importante d'informations recueillies à son sujet.
Techniques classiques
Méthodes de dilution Les méthodes de dilution sont effectuées en milieu liquide ou en milieu solide. Elles consistent à mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de concentrations croissantes d'antibiotiques selon une progression géométrique de raison 2. En milieu liquide (schéma 1), l'inoculum bactérien est distribué dans une série de tubes (méthode de macrodilution) ou de cupules (méthode de microdilution) contenant l'antibiotique. Après incubation, la CMI est indiquée par le tube ou la cupule qui contient la plus faible concentration d'antibiotique et où aucune croissance n'est visible.
En milieu solide (schéma 1), l'antibiotique est incorporé dans un milieu gélosé coulé en boîtes de Pétri. La surface de la gélose est ensemencée avec un inoculum des souches à étudier (un inoculateur à têtes multiples, appareil de Steers, permet d'ensemencer de 20 à 30 souches différentes par boîte). Après incubation, la CMI de chaque souche est déterminée par l'inhibition de la croissance sur le milieu contenant la plus faible concentration d'antibiotique.
Les techniques de dilution en milieu gélosé permettent également de mesurer la concentration inhibitrice 99 p. cent (concentration qui inhibe la croissance de 99 p. cent des cellules d'une souche bactérienne) ou la concentration inhibitrice 50 p. cent (concentration qui inhibe la croissance de 50 p. cent des cellules d'une souche bactérienne). Les déterminations des concentrations inhibitrices 99 p. cent et 50 p. cent sont plus précises que la détermination des CMI puisque les écarts-types moyens sont respectivement de 0,3 log base 2 et de 0,07 log base 2 contre 0,7 log base 2 pour la CMI. Dans la pratique courante, les méthodes de dilution sont de mise en œuvre délicate et/ou onéreuses et elles sont réservées à des laboratoires spécialisés.
Méthodes de diffusion : antibiogramme standard Les méthodes de diffusion ou antibiogrammes standards sont les plus utilisées par les laboratoires de diagnostic. Des disques de papier buvard, imprégnés des antibiotiques à tester, sont déposés à la surface d'un milieu gélosé, préalablement ensemencé avec une culture pure de la souche à étudier. Dès l'application des disques, les antibiotiques diffusent de manière uniforme si bien que leurs concentrations sont inversement proportionnelles à la distance du disque. Après incubation, les disques s'entourent de zones d'inhibition circulaires correspondant à une absence de culture (schéma 2). Lorsque la technique est parfaitement standardisée, les diamètres des zones d'inhibition dépendent uniquement de la sensibilité du germe. A la limite des zones d'inhibition, il existe dans la gélose des concentrations d'antibiotiques égales aux CMI. Les méthodes de diffusion ne permettent pas de chiffrer directement ces valeurs. Toutefois, il existe une relation simple entre les diamètres des zones d'inhibition et les log2 des CMI mesurées par les techniques de dilution. Ces relations, appelées droites de concordance ou droites de régression (schéma 3), ont été établies par des laboratoires spécialisés travaillant dans des conditions standardisées. A condition de respecter un protocole identique, ces courbes sont utilisables par un laboratoire de diagnostic.
Standardisation
La fiabilité des résultats d'un antibiogramme est influencée par de nombreux paramètres qui doivent être rigoureusement contrôlés. La standardisation est régie par des documents émanant de l'O.M.S. et des divers comités nationaux (pour la France, le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie et, pour la bactériologie animale, le Comité Français d'Accréditation). Selon les pays, il peut exister des variations techniques et il est important de respecter une technique identique à celle utilisée pour l'établissement des courbes de concordance.
Le besoin d'une harmonisation européenne dans la méthodologie des tests a conduit, en 2002, à la création de l'EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptbility Testing). Le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie prend une part active à l'EUCAST et elle est l'un des six comités nationaux reconnus par cet organisme.
Résultats
Expression des résultats (schéma 4)
Les résultats quantitatifs (CMI en mg/L) sont le plus souvent interprétés par les laboratoires en terme de possibilité thérapeutique. Cette interprétation consiste à comparer les valeurs des CMI avec les concentrations critiques établies pour les diverses classes d'antibiotiques.
Schématiquement, la concentration critique supérieure correspond à la plus grande quantité d'antibiotique actif que l'on peut obtenir dans le sérum et les tissus à la suite d'un traitement effectué à la posologie habituelle et la concentration critique inférieure correspond à la plus faible concentration humorale et tissulaire d'antibiotique actif.
En réalité, les critères permettant d'établir les valeurs des concentrations critiques sont multiples :
La prise en compte de ces différents critères permet de dresser un tableau des concentrations critiques pour les principaux antibiotiques. Selon le poids attribué à tel ou tel critère, il est normal d'observer des variations d'opinion aussi, il n'existe pas d'accord au plan international et l'O.M.S. confie l'établissement des tableaux des concentrations critiques aux autorités nationales. En France, ce tableau est établi, chaque année, par le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie.
L'établissement d'un tel tableau permet une catégorisation clinique.
La confrontation des CMI aux concentrations critiques permet donc aux laboratoires de donner les résultats sous la forme de bactérie sensible, intermédiaire ou résistante à un antibiotique. Selon le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie [voir les Recommandations du Comité de l'Antibiogramme (CA-SFM)], les définitions de bactérie sensible, intermédiaire ou résistante sont les suivantes : . Une souche sensible est une souche pour laquelle la probabilité de succès thérapeutique est forte dans le cas d'un traitement par voie systémique avec la posologie recommandée dans le résumé des caractéristiques du produit (RCP).
. Une souche de sensibilité intermédiaire est une souche pour laquelle le succès thérapeutique est imprévisible. Ces souches forment un ensemble hétérogène pour lequel les résultats obtenus in vitro ne sont pas prédictifs d'un succès thérapeutique. En effet, ces souches :
. Une souche résistante est une souche pour laquelle il existe une forte probabilité d'échec thérapeutique quels que soient le type de traitement et la dose d'antibiotique utilisée.
Lecture interprétative de l'antibiogramme
La lecture interprétative de l'antibiogramme est fondée sur la connaissance des phénotypes de résistance. Elle a pour principal but de transformer un résultat catégorisé "sensible" en un résultat "intermédiaire" ou "résistant" en raison d'un risque d'échec thérapeutique. De plus, pour quelques couples bactérie antibiotique, malgré une catégorisation " sensible ", le risque accru de sélection in vivo de mutants résistants justifie un commentaire particulier destiné au clinicien. La lecture interprétative nécessite une identification correcte de la souche et une méthode d'antibiogramme parfaitement standardisée. La mise en évidence de phénoypes de résistance hautement improbables compte tenu de l'identification de la souche doit conduire à vérifier l'identification bactérienne, à contrôler la pureté de l'inoculum et à contrôler la technique de l'antibiogramme.
Généralisation des résultats à des antibiotiques non testés Le choix des antibiotiques testés repose avant tout sur l'identification du germe et sur la connaissance de sa résistance naturelle. Ce choix dépend également du site de l'infection et de l'espèce animale infectée. Parmi les antibiotiques susceptibles d'être utilisés en thérapeutique, toutes les molécules ne sont pas prises en compte. En effet, la connaissance des familles d'antibiotiques et des mécanismes de résistance croisée permet de ne faire figurer dans l'antibiogramme qu'un nombre restreint de molécules représentatives. Quelques exemples de généralisation des résultats à des molécules non testées sont donnés dans le tableau II. Des renseignements complémentaires figurent dans les Recommandations du Comité de l'Antibiogramme (CA-SFM).
Autres techniques
Techniques en milieu liquide La détermination de la sensibilité peut se réaliser en milieu liquide en testant la sensibilité de la souche bactérienne vis-à-vis des concentrations critiques supérieures et inférieures des différents antibiotiques ou uniquement vis-à-vis des concentrations critiques inférieures. Ces méthodes simplifiées sont commercialisées, par exemple "ATB Antibiogramme" (bioMérieux) ou "ATB VET" (bioMérieux) (schéma 5), ce qui les rend accessibles aux laboratoires de diagnostic. L'inoculation des galeries et la lecture des résultats peuvent se réaliser manuellement ou à l'aide d'automates.
Technique en milieu gélosé : le Etest® La détermination précise de la CMI par la méthode de référence est difficilement utilisable en pratique quotidienne. La commercialisation d'une technique rapide et simple, le Etest (AB Biodisk), permet à un laboratoire de diagnostic de mesurer la CMI (schéma 6). Le Etest permet de déterminer la CMI grâce à l'utilisation de bandelettes imprégnées d'un gradient exponentiel continu de l'antibiotique à tester. Ce gradient couvre une zone qui, en fonction des molécules, va de 0,016 à 256 mg/L ou de 0,002 à 32 mg/L. Le Etest associe les caractéristiques des méthodes de diffusion et de dilution en milieu solide. Les bandelettes (supports inertes, hydrophobes, de 5 mm de largeur et de 50 mm de longueur) sont appliquées sur la surface d'un milieu gélosé préalablement ensemencé avec un inoculum de la souche à étudier. Après incubation, l'inhibition de la croissance se traduit par une ellipse d'inhibition dont les points d'intersection avec la bandelette définissent la CMI. Une échelle de lecture, imprimé sur la bandelette, permet une interprétation rapide.
Limites de l'antibiogramme
Limites techniques La réalisation d'un antibiogramme est soumise au respect de conditions techniques qui sont parfois incomplètement et insuffisamment respectées.
Un antibiogramme doit obligatoirement être effectué sur une culture pure et identifiée. Cette dernière condition permet d'ajuster la densité de l'inoculum, de choisir judicieusement les antibiotiques à tester et de pratiquer une lecture interprétative.
Tout laboratoire devrait vérifier la validité de sa technique en testant, au moins une fois par mois, la sensibilité des souches de référence et vérifier que les diamètres des zones d'inhibition obtenues vis-à-vis des divers antibiotiques sont conformes aux valeurs publiées par le Comité de l'Antibiogramme.
Les techniques de l'antibiogramme ont été standardisées uniquement pour les bactéries cultivant rapidement sur milieux usuels. Lorsque la souche isolée ne rentre pas dans ce cadre, l'interprétation est parfois délicate :
La technique des disques s'applique mal à l'évaluation de la sensibilité à des molécules qui diffusent peu dans la gélose ce qui est le cas des polymyxines ou des glycopeptides et toute résistance devrait être confirmée par la mesure de la CMI.
Limites dans l'interprétation des résultats Comparaison CMI / concentrations critiques Durant de nombreuses années, les valeurs des concentrations critiques n'avaient été établies que chez l'homme et les bactériologistes vétérinaires confrontaient les résultats des CMI à des chiffres certainement erronés pour les animaux.
Pour remédier à cette situation, le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie a créé un groupe de travail vétérinaire. Ce groupe a défini une liste des concentrations et diamètres critiques par espèce bactérienne. La liste des antibiotiques se limite aux molécules autorisées en médecine vétérinaire et pour lesquelles des disques sont disponibles en France. Le communiqué du groupe de travail vétérinaire est disponible sur Internet (voir le Communiqué du Groupe de travail : Antibiogramme Vétérinaire). Ce communiqué présente les concentrations critiques, les diamètres critiques et les règles de lecture interprétative pour les souches vétérinaires appartenant aux familles des Enterobacteriaceae et des Pasteurellaceae et pour les souches des genres Staphylococcus et Streptococcus.
Incertitude sur l'étiologie de l'infection "Le clinicien en possession d'un résultat (...) mentionnant le nom d'une bactérie qui lui est familière et l'antibiogramme correspondant, a fréquemment du mal à concevoir que ce résultat peut être sans intérêt, même nocif. Le choix erroné de la bactérie responsable de l'infection constitue l'une des causes les plus fréquentes de discordance observée entre les résultats in vitro et in vivo." (Goldstein). En effet, l'antibiogramme ne peut apporter une aide que dans la mesure où il est effectué sur la bactérie véritablement responsable de l'infection. Parmi les bactéries isolées d'un prélèvement, le laboratoire doit faire un choix et n'effectuer l'antibiogramme que sur l'espèce ou les espèces susceptibles de jouer un rôle étiologique. Ce choix n'est possible que dans la mesure où le bactériologiste possède des connaissances en pathologie infectieuse vétérinaire et dans la mesure où il dispose d'une fiche de commémoratifs détaillée. Évaluation de l'intensité d'action d'un antibiotique L'antibiogramme ne renseigne que sur l'activité bactériostatique. L'étude du pouvoir bactéricide d'un antibiotique sur la souche isolée nécessite d'autres tests rarement effectués en pathologie animale. Toutefois, si l'état de santé de l'animal nécessite le recours à un agent bactéricide, le vétérinaire peut choisir, parmi les antibiotiques actifs, une des molécules ayant généralement un effet bactéricide (bêta-lactamines, aminosides, polymyxines, quinolones de 2ème génération...). Association d'antibiotiques D'une manière générale, l'antibiogramme ne permet pas la mise en évidence des interactions éventuelles entre deux agents antimicrobiens et l'étude des synergies ou antagonismes nécessite des tests complémentaires. En l'absence de tests complémentaires, le respect des lois de Jawetz et Gunisson peut permettre d'éviter les erreurs les plus grossières. Lois de Jawetz et Gunisson
Il existe toutefois deux cas particuliers où l'antibiogramme est apte à donner des indications sur les associations :
Cas particulier des streptocoques et des entérocoques
La détermination de la sensibilité des streptocoques et des entérocoques aux aminosides permet au clinicien de prédire l'effet d'une association aminoside-bêta-lactamine.
En pratique, la réponse streptocoque ou entérocoque résistant à un aminoside signifie que son association avec une bêta-lactamine n'est pas souhaitable. Inversement, la réponse sensible signifie que l'aminoside pourra être utilisé mais uniquement en association avec une bêta-lactamine et à condition que la souche soit sensible aux bêta-lactamines. Une interprétation plus fine des divers résultats est donnée dans le tableau II. Absence de parallélisme entre les situations in vitro et in vivo
L'antibiogramme ne peut prédire le comportement d'un antibiotique in vivo. Celui-ci est fonction de multiples facteurs :
Conclusion
Les difficultés techniques et les limites de validité évoquées ci-dessus ne doivent pas faire conclure à l'inutilité de l'antibiogramme. "Ça marche ! ". Cette affirmation de Chabbert semble également vraie en médecine vétérinaire. Il reste cependant beaucoup à faire pour utiliser au mieux cet examen. Des efforts de la part des laboratoires et des cliniciens sont nécessaires :
AVIS JURIDIQUE IMPORTANT : Les informations qui figurent sur ce site sont soumises à une clause de non responsabilité et sont protégées par un copyright.
|