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Conjugaison bactérienne
Définition et découverte
La conjugaison est un transfert génétique unidirectionnel, à déterminisme plasmidique, qui s'effectue entre des bactéries "sexuellement" différenciées et qui nécessite un contact étroit entre une bactérie donatrice (ou mâle) et une bactérie réceptrice (ou femelle). Avant 1945, des associations bactériennes ressemblant à des accouplements avaient été observées, mais leur étude n'avait jamais dépassé un stade descriptif. En 1945, Joshua Lederberg décide d'utiliser des mutants auxotrophes pour mettre en évidence un transfert de gènes impliquant un accouplement entre bactéries. Ses premiers essais, utilisant des mutants de Escherichia coli auxotrophes soit pour la méthionine soit pour la proline, ne furent pas concluants. En 1946, Lederberg apprend que Edward Lawrie Tatum a obtenu des souches de Escherichia coli K12 poly-auxotrophes et il décide de poursuivre ses travaux avec ces mutants. L'utilisation de souches poly-auxotrophes présente en effet un avantage majeur car la réversion vers l'état prototrophe est très rare. Comme c'est souvent le cas lors de découvertes majeures Lederberg a été aidé par la chance. En effet, les souches de Escherichia coli K12 hébergent un plasmide (le facteur F ; Cf. infra), nécessaire à la conjugaison, alors que la très grande majorité des souches de Escherichia coli sont dépourvues de ce plasmide. De plus, parmi les mutants de Tatum, il a utilisé la souche 679-680 (auxotrophe pour la leucine et la thréonine), souche qui a secondairement perdu son plasmide F. Ce fait a une importance considérable car un transfert de gènes lors de la conjugaison nécessite que la bactérie réceptrice soit dépourvue du plasmide F.
L'expérience princeps, effectuée en 1946 par Lederberg et Tatum, a fait appel à deux souches A et B de Escherichia coli K12 poly-auxotrophes (voir schéma 1). La souche A est auxotrophe pour la thréonine et la leucine (il s'agit en fait de la souche 679-680 citée plus haut) et la souche B est auxotrophe pour la biotine, la méthionine et la thiamine. La culture de ces deux souches sur un milieu gélosé dépourvu de thréonine, de leucine, de biotine, de méthionine et de thiamine ne conduit à l'apparition d'aucune colonie. En revanche, si on étale sur ce milieu un bouillon ensemencé avec un mélange des deux souches, on obtient une colonie pour environ 107 bactéries ensemencées. La possibilité d'apparition de mutants peut être exclue car une mutation survient à une fréquence d'environ 10-7 pour un caractère et une mutation double ou triple apparaîtrait avec des fréquences respectives de 10-14 ou 10-21, ce qui ne correspond pas aux résultats observés.
Le transfert génétique observé par Lederberg et Tatum diffère d'une transformation ou d'une transduction (mécanisme inconnu à l'époque) et il n'est pas dû à une quelconque substance nutritive diffusible (cross-feeding), car il nécessite un contact entre les deux souches bactériennes. La nécessité d'un contact a été mise en évidence par Bernard Davis en utilisant un tube en U séparé à la base par une membrane en verre fritté empêchant un contact entre les souches, mais laissant passer l'ADN libre, les phages ou les substances solubles. Dans ces conditions, si les deux souches sont placées chacune dans une branche du tube, aucune bactérie prototrophe n'est obtenue, même si le milieu est aspiré et refoulé plusieurs fois (voir schéma 2).
Mise en évidence d'une différenciation sexuelle
En 1952, William Hayes montre que les deux souches parentales utilisées par Lederberg et Tatum n'ont pas le même comportement au cours de la conjugaison.
Expérience 1a (voir schéma 3)
La souche A, auxotrophe pour la thréonine et la leucine, est résistante à la streptomycine.
Expérience 1b (voir schéma 3)
La souche A, auxotrophe pour la thréonine et la leucine, est sensible à la streptomycine.
En comparant les résultats de ces deux expériences il apparaît que la viabilité de la souche A est nécessaire pour obtenir des recombinants.
Expérience 2 (voir schéma 4)
Les deux souches parentales utilisées sont sensibles à la streptomycine.
L'ensemble de ces résultats conduit à admettre l'existence d'une différenciation sexuelle entre les souches A et B.
Hayes remarqua également que la souche donatrice pouvait donner naissance à un variant "stérile", incapable de donner des recombinants et se comportant comme une bactérie réceptrice. Hayes suggéra alors que le caractère donneur était sous la dépendance d'un facteur de fertilité (facteur F).
Le facteur F est en fait le premier plasmide conjugatif mis en évidence chez les bactéries. Le facteur F est un gros plasmide (94 500 pb) qui contrôle sa propre réplication, son nombre de copies, la répartition des copies dans les cellules filles et son transfert (voir schéma 5).
L'union entre une bactérie donatrice et une bactérie réceptrice, effectuée grâce aux pili sexuels, est suivie de la création d'un pont cytoplasmique permettant le transfert de l'ADN. Ce transfert débute à l'origine de transfert ou oriT et se déroule selon le modèle du cercle roulant. Un brin d'ADN pénètre dans la bactérie réceptrice puis, aussi bien chez la bactérie donatrice que chez la bactérie réceptrice, le brin complémentaire sera synthétisé (voir schéma 6). En conséquence, le facteur F persiste chez la bactérie donatrice (qui reste F+) et une copie du facteur F est acquise par la bactérie réceptrice (qui devient F+).
Les bactéries Hfr
Au cours d'un croisement F+ X F-, la fréquence des recombinaisons chromosomiques est approximativement de 10-7. En 1953, Luca Cavalli-Sforza découvrit de nouvelles souches, dérivées de bactéries F+, et capables de transférer des marqueurs chromosomiques avec une fréquence 1000 fois plus importante. Ces souches furent désignées Hfr pour haute fréquence de recombinaison (high frequency of recombinaison). Dans un croisement Hfr X F- les bactéries F- ne deviennent généralement pas F+ ou Hfr. Chez les bactéries Hfr, le facteur F n'est plus autonome et il est intégré au chromosome bactérien (voir schéma 7). Un plasmide, capable de s'intégrer dans le chromosome, est appelé un épisome. Le facteur F et le chromosome de Escherichia coli contiennent des transposons et des séquences d'insertion capables de recombinaison. Aussi, l'intégration du facteur F dans le chromosome peut se faire à différents endroits.
En 1957, Elie Wollman et François Jacob étudient la chronologie du transfert des gènes chromosomiques, lors d'un croisement Hfr X F-, par la technique des conjugaisons interrompues.
Wollman et Jacob avaient constaté que l'ordre dans lequel les marqueurs chromosomiques sont transférés était variable selon les souches Hfr utilisées. L'explication de cette observation a été fournie par Allan Campbell. Cet auteur a supposé que le facteur F et le chromosome étaient des molécules d'ADN circulaires, si bien que lorsque le facteur F s'intègre dans le chromosome, on obtient un chromosome circulaire d'une taille plus importante (voir schéma 7 et schéma 8). Lors d'une conjugaison, l'un des brins d'ADN chromosomique est transmis de manière linéaire à la bactérie réceptrice (voir schéma 8). Le transfert commence à l'origine de transfert et s'effectue ensuite de manière orientée et progressive. Comme le facteur F peut s'intégrer dans différents endroits du chromosome, l'ordre des gènes transférés peut varier d'une souche Hfr à une autre. Lors du transfert l'intégrité du génome de la bactérie donatrice est assurée par un processus de réplication asymétrique. L'ADN monocaténaire transféré est également répliqué dans la bactérie réceptrice et les gènes transférés peuvent être incorporés dans le chromosome de la bactérie réceptrice par crossing-over (recombinaison réciproque entre deux molécules d'ADN homologues). Si la conjugaison n'est pas interrompue, le chromosome entier est transmis en environ 120 minutes.
Dans une conjugaison F+ X F-, l'obtention de recombinants s'explique par le fait que dans une population de bactéries F+ environ une cellule sur mille est dans un état Hfr suite à une intégration du facteur F dans le chromosome. Le pourcentage de bactéries réceptrices ayant acquis des marqueurs chromosomiques est faible. En revanche, lorsqu'une bactérie Hfr est isolée et cultivée, elle donne naissance à un clone bactéries Hfr dont toutes les cellules sont capables de transférer des marqueurs chromosomiques avec une grande fréquence.
Les facteurs F'
L'intégration du facteur F dans le chromosome est un événement réversible et le facteur F peut retrouver son indépendance. Généralement l'excision du facteur F s'effectue correctement mais, dans quelques cas, l'excision est incorrecte et le facteur F emporte avec lui une petite fraction du chromosome (voir schéma 7). Le facteur F possède alors toute l'information génétique nécessaire à la conjugaison et, de plus, il porte un ou quelques marqueurs chromosomiques. Un facteur F ainsi modifié est appelé F'. Lors d'une conjugaison F' X F- le facteur F' est transmis à haute fréquence à la bactérie réceptrice qui acquiert avec le plasmide un ou quelques gènes chromosomiques. On parle de F-duction ou de sex-duction.
Résumé
La conjugaison est sous la dépendance d'un plasmide conjugatif qui code notamment pour la synthèse de pili sexuels, pour des protéines responsables d'une exclusion de surface, pour sa réplication et pour sa propre mobilisation. Le facteur F est le premier plasmide conjugatif mis en évidence. Le facteur F peut être présent à l'état autonome ou il peut s'intégrer dans le chromosome bactérien (bactérie Hfr). L'intégration est réversible et le facteur F peut retrouver son autonomie. L'excision du facteur F est parfois anormale et il emporte avec lui un fragment du chromosome adjacent à son site d'intégration (facteur F'). Les différentes modalités de croisement sont les suivantes : . Les croisements F- X F- sont impossibles (les deux bactéries sont dépourvues de facteur F). . Les croisements F+ X F+ sont impossibles (exclusion de surface). . Lors d'un croisement F+ X F-, le facteur F est transmis à haute fréquence, la bactérie réceptrice devient F+, mais aucun gène chromosomique n'est transmis. . Les croisements Hfr X Hfr sont impossibles (exclusion de surface). . Lors d'un croisement Hfr X F-, le facteur F n'est que rarement transmis à la bactérie réceptrice qui reste F-. En revanche, des gènes chromosomiques sont transmis à haute fréquence. Ces gènes ne pourront s'intégrer dans le chromosome de la bactérie réceptrice que dans la mesure où les génomes de la bactérie donatrice et de la bactérie réceptrice présentent de fortes homologies. Le transfert d'ADN chromosomique par conjugaison entre une bactérie Hfr et une bactérie F- n'est possible qu'entre bactéries d'une même espèce et il a été principalement observé chez des bactéries à Gram négatif (entérobactéries, Pseudomonas spp.). . Les croisements F' X F' sont impossibles (exclusion de surface). . Lors d'un croisement F' X F-, le facteur F' est transmis à haute fréquence, la bactérie réceptrice devient F' et elle acquiert un ou quelques gènes de la bactérie donatrice. Si les génomes des bactéries donatrices et réceptrices présentent de fortes homologies, le gène (ou les gènes) acquis peut (ou peuvent) s'intégrer dans le chromosome de la bactérie réceptrice (recombinaison légitime). Dans le cas contraire, il ne s'intègre pas et il devient un gène transmissible à haute fréquence.
Conséquences et applications
La conjugaison a permis d'étudier le groupe de liaison entre les gènes (linkage) et de dresser la carte génétique des bactéries. Dans le cas de conjugaisons interrompues, la cinétique d'entrée des différents marqueurs chromosomiques révèle les groupes de liaison. La vitesse de transfert étant relativement constante, le temps d'entré des marqueurs permet d'évaluer la distance qui les sépare. On a pu ainsi dresser la carte génétique de Escherichia coli [voir par exemple la carte génétique de Escherichia coli sur le site "Genetics" (Randall K. Holmes & Michael G. Jobling)]. La conjugaison a permis de découvrir les plasmides et de mettre en évidence la circularité du chromosome bactérien et des plasmides.
La conjugaison ne se limite pas au facteur F et de nombreux plasmides conjugatifs ont été décrits chez des bactéries à Gram positif et à Gram négatif.
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