J.P. Euzéby : Abrégé de Bactériologie Générale et Médicale à l'usage des étudiants de l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse
 

Bactériologie Générale
Bactériologie Médicale

Autres sites Web : List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature - Dictionnaire de Bactériologie Vétérinaire - SBSV
 

Standardisation de l'antibiogramme

Les principales recommandations concernant la standardisation de l'antibiogramme par la technique de diffusion sont données ci-dessous.

. Le milieu de culture doit permettre la croissance de nombreuses bactéries et il ne doit pas contenir d'inhibiteurs des antibiotiques. Le milieu retenu pour la majorité des espèces bactériennes est celui de Mueller-Hinton.
La gélose de Mueller-Hinton est enrichie de 5 p. cent de sang de mouton pour les streptocoques, de 5 p. cent de sang de mouton ou de cheval pour les campylobactéries, de 10 p. cent de cheval pour Helicobacter pylori ou de 5 p. cent de sang de cheval hémolysé pour l'étude de la sensibilité des streptocoques vis-à-vis d'une association sulfamide-triméthoprime.
Pour Haemophilus influenzae et Neisseria gonorrhoeae (germes dépourvus d'intérêt en médecine vétérinaire), le milieu de Mueller-Hinton est remplacé par une gélose chocolat PolyVitex® et pour les bactéries anaérobies par une gélose Wilkins Chalgren additionnée de 5 p. cent de sang de mouton (ou une gélose Brucella contenant 1 mg/L de vitamine K1 et 5 p. cent de sang).
Dans le cas particulier de la recherche de la résistance à la méticilline de Staphylococcus aureus subsp. aureus, il est possible d'utiliser un milieu de Mueller-Hinton hypersalé.

. Les teneurs en calcium et en magnésium doivent être contrôlées car des concentrations trop élevées inhibent l'action des aminosides (réduction de la fixation sur la membrane externe de certaines bactéries à Gram négatif), des tétracyclines (chélation) et des polymyxines.

. La teneur en thymidine doit être fixe car elle nuit à l'activité des sulfamides.

. Le pH influence l'activité de plusieurs antibiotiques (les aminosides et les macrolides sont plus actifs en milieu alcalin alors que les tétracyclines sont plus actives en milieu acide) et il doit être compris entre 7,2 et 7,4 (valeur qui permet une bonne croissance bactérienne et qui réalise un compromis pour l'activité des antibiotiques).

. Pour les méthodes de diffusion, la source d'antibiotique est en fait constituée par le disque et le cylindre de gélose sous-jacente. L'épaisseur de la gélose va donc conditionner la concentration de la source d'antibiotique et elle doit être de 4 mm.

. Les antibiotiques ainsi que les disques doivent être standardisés. Cette standardisation est effectuée par les fabriquants et le laboratoire a pour unique responsabilité de stocker les disques dans des conditions optimales et de ne pas utiliser des disques périmés. Avant utilisation, les disques doivent être amenés à température ambiante. Toute cartouche ouverte doit être utilisée dans les cinq jours.

. La densité de l'inoculum bactérien est un élément primordial et elle doit être ajustée à l'aide d'un photomètre ou par comparaison avec un étalon d'opacité (échelle de McFarland).
En France, l'antibiogramme par diffusion est réalisé avec une suspension contenant environ 10⁶ bactéries par mL (ensemencement par inondation) ou 10⁷ bactéries par mL (ensemencement par écouvillonage). Pour certaines bactéries, l'inoculum doit être plus important : 10⁷ bactéries par mL (ensemencement par inondation) ou 10⁸ bactéries par mL (ensemencement par écouvillonage) pour les streptocoques ou les campylobactéries, 10⁸ pour les bactéries anaérobies et 10⁹ pour Helicobacter pylori.
Pour les méthodes de dilution en milieu gélosé, les spots doivent renfermer environ 10⁴ bactéries et ce nombre est porté à 10⁵ pour les campylobactéries ou pour les bactéries anaérobies et à 10⁶ pour Neisseria gonorrhoeae.

. Une phase de pré-diffusion des antibiotiques peut conduire à l'obtention de zones d'inhibition plus importantes. Selon les pays, une pré-diffusion est ou non préconisée. En France, la technique du "Comité de l'Antibiogramme de la SFM" ne prévoit pas de pré-diffusion. En revanche, la technique du "Swedish Reference Group for Antibiotics (SRGA) and its subcommittee on methodology (SRGA-M)" impose une phase de pré-diffusion.

. La température et la durée d'incubation doivent être fixes. Pour la majorité des bactéries l'incubation est effectuée à 35-37 °C durant 18-24 heures dans une atmosphère normale.
Pour Neisseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae, l'incubation est réalisée dans une atmosphère contenant 5 p. cent de dioxyde de carbone.
Pour les Campylobacter sp. l'incubation est effectuée en micro-aérophilie ou en anaérobiose.
La durée de l'incubation, effectuée dans une atmosphère dépourvue d'oxygène, est portée à 48 heures pour les bactéries anaérobies et à 72 heures (dans une atmosphère micro-aérophile) pour Helicobacter pylori.
Dans le cas particulier de la recherche de la résistance à la méticilline de Staphylococcus aureus subsp. aureus, il est possible d'utiliser soit une gélose de Mueller-Hinton hypersalée (2 à 4 p. cent) et incubée à 37 °C soit une gélose de Mueller-Hinton incubée à 30 °C. L'incubation peut éventuellement être prolongée jusqu'à 48 heures si la croissance est faible.

. La technique doit être régulièrement contrôlée avec des souches de référence. Les souches recommandées par le Comité de l'Antibiogramme de la SFM sont les suivantes : la souche ATCC 25922 (= CIP 76.24 = DSM 1103 = NCIB 12210 = JCM 5491) de Escherichia coli, la souche ATCC 27853 ( = CIP 76.110 = DSM 1117 = LMG 6395) de Pseudomonas aeruginosa, la souche ATCC 25923 (= CIP 76.25 = DSM 1104 = JCM 2413 = NCTC 12981) de Staphylococcus aureus subsp. aureus, la souche CIP 107808 de Providencia stuartii et la souche CIP 104485 (= CNRP 16000) de Streptococcus pneumoniae.

La mise en place d'un contrôle de qualité interne a fait l'objet de recommandations de la part du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie [voir les Recommandations du Comité de l'Antibiogramme (CA-SFM)] :
Lors de sa première mise en œuvre par un laboratoire, la technique de diffusion doit être réalisée quotidiennement 8 à 10 jours de suite afin de la maîtriser, avec les souches de référence et les antibiotiques suivants : pénicilline G, oxacilline, amoxicilline, amoxicilline/acide clavulanique, ticarcilline, pipéracilline, céfalotine, céfotaxime, ceftazidime, imipénème, gentamicine, tobramycine, amikacine, acide nalidixique, péfloxacine, ciprofloxacine, triméthoprime/sulfaméthoxazole, érythromycine, lincomycine, pristinamycine, rifampicine, acide fusidique, fosfomycine, colistine, vancomycine et teicoplanine.
Le maintien de la qualité est ensuite vérifié au minimum une fois par mois. Si des résultats corrects ne sont pas obtenus, des mesures correctives sont mises en place, impliquant alors de revenir à la première étape du contrôle de qualité.

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