J.P. Euzéby : Abrégé de Bactériologie Générale et Médicale à l'usage des étudiants de l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse
 

Bactériologie Générale
Bactériologie Médicale

Autres sites Web : List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature - Dictionnaire de Bactériologie Vétérinaire - SBSV
 

Mutations bactériennes

Définition et mise en évidence

Une mutation est une modification brusque, rare, aléatoire et héréditaire du génome bactérien. Il n'y a pas de différence de nature entre la mutation d'une cellule procaryote et la mutation d'une cellule eucaryote.

Pour révéler la présence d'une mutation, il est nécessaire d'utiliser une technique sélective. Par exemple, un milieu contenant un antibiotique pour identifier un mutant résistant à cet antibiotique, un milieu contenant un facteur de croissance pour mettre en évidence un mutant auxotrophe pour ce facteur de croissance, un milieu contenant des bactériophages virulents pour caractériser un mutant résistant à la lyse, etc.

Un moyen simple de mise en évidence d'une mutation est présenté dans le schéma 1. Une unique cellule bactérienne sensible à la streptomycine est cultivée dans un bouillon apte à assurer sa croissance. Par définition, sa multiplication donnera naissance à un clone. En ensemençant 10⁸ ou 10⁹ bactéries issues de ce clone sur un milieu contenant de la streptomycine, on peut voir apparaître une ou quelques colonies qui sont donc constituées de bactéries ayant acquis une propriété nouvelle : celle de résister à la streptomycine. Ces bactéries sont des mutants capables de transmettre la résistance à la streptomycine à leur descendance.

Les différents types de mutation

Toute modification de la séquence nucléotidique d'un gène constitue une mutation. Ces modifications sont liées (i) à la substitution d'une base, (ii) à la délétion ou à l'addition d'une base (iii) à la perte ou à l'addition ou à l'inversion de séquences d'ADN.

Mutations ponctuelles

La substitution d'une base ainsi que la délétion ou l'addition d'une base conduisent à des mutations ponctuelles.

Substitution

On parle de transition lorsqu'une base purique est remplacée par une autre base purique ou lorsqu'une base pyrimidique est remplacée par une autre base pyrimidique.
On parle de transversion si une base purique est remplacée par une base pyrimidique ou vice versa.

La substitution conduit à des mutations silencieuses ou à des mutations faux sens ou à des mutations non-sens.
. La mutation est silencieuse si la substitution ne modifie pas la nature de l'acide aminé. Par exemple, si le codon UUC est modifié en un codon UUU, la mutation sera silencieuse car ces deux codons codent pour la phénylalanine.
. Lors d'une mutation faux sens, un acide aminé d'une protéine est remplacé par un autre acide aminé. Par exemple, si le codon CUU est remplacé par le codon UUU, la phénylalanine remplacera la leucine dans le peptide synthétisé. Une mutation faux sens modifie le phénotype si l'acide aminé qui a été remplacé jour un rôle majeur dans le repliement de la protéine ou dans l'activité de la protéine. Cependant, de nombreuses mutations faux sens n'ont pas de répercussions phénotypiques car l'acide aminé modifié n'a qu'un rôle mineur dans l'activité de la protéine.
. Une mutation est qualifiée de non-sens lorsque la substitution provoque la formation d'un codon stop (UAG, UAA ou UGA). La protéine synthétisée sera alors une protéine tronquée. Une mutation non-sens dans un opéron polycistronique peut affecter non seulement le cistron muté mais encore les gènes distaux. On dit que la mutation a un effet polaire.

Addition ou délétion d'une base

L'addition ou la délétion d'une seule paire de base modifie le cadre de lecture de l'ARNm et a des répercussions sur tous les codons situés en aval. De telles mutations ont généralement des répercussions phénotypiques.

Mutations par délétion ou insertion ou inversion de séquences

Deux cassures de l'ADN peuvent survenir et conduire à la perte du segment d'ADN compris entre ces deux cassures. De telles mutations sont fréquemment létales.

Des séquences d'ADN peuvent être insérées ou dupliquées ou changées dans leur orientation. Ces mutations sont dues à des éléments génétiques mobiles tels que des séquences d'insertion, des transposons, des phages tempérés ou des épisomes (plasmides pouvant s'intégrer de manière réversible dans le chromosome).

Si le nombre de paires de bases enlevées ou insérées est un multiple de trois le cadre de lecture n'est pas altéré, mais la protéine est allongée d'un ou de quelques acides aminés ce qui peut altérer sa fonction.

Les agents mutagènes

Les mutations sont provoquées par des agents physiques ou chimiques ou biologiques qui sont qualifiés de mutagènes.

Les rayons ultraviolets, à la longueur d'onde de 260 nm, provoquent la formation de dimères (création de liaisons covalentes) entre deux bases pyrimidiques adjacentes (situées sur le même brin d'ADN). Les dimères de thymine et de cytosine ainsi constitués provoquent une distorsion locale de la structure en double hélice (ce qui bloque l'ADN polymérase III) et une rupture des liaisons hydogène avec les bases situées sur l'autre brin. De telles mutations sont généralement létales.

Les radiations ionisantes (rayons X, alpha, bêta, gamma) sont responsables de cassures, d'ouvertures des cycles des bases et d'oxydations (l'énergie de ces radiations dans un milieu aqueux produit de l'eau oxygénée et des radicaux libres très actifs). Ces mutations sont fréquemment létales.

Les analogues des bases comme la 5-bromo-uracile (analogue de la thymine) provoquent des mutations par substitution. Elle est incorporée à la place de la thymine et elle s'associe avec la guanine si bien que la paire originale TA est remplacée par la paire GC.

L'acide nitreux provoque une désamination de la cytosine et  de l'adénine. La paire AT est remplacée par la paire GC et la paire GC par la paire AT.
L'hydroxylamine modifie la cytosine et la paire GC est remplacée par la paire AT.

Les agents alkylants monofonctionnels (par exemple l'éthylméthanesulfonate) méthylent la guanine qui va alors s'associer à la thymine.
Les agents alkylants bifonctionnels (par exemple la N-nitro-N'-nitrosguanidine) sont responsables de l'addition de groupement aliphatiques sur les bases et ils provoquent la formation de liens entre les brins d'ADN. Ce sont de puissants mutagènes provoquant des mutations ponctuelles et des délétions.

Les agents intercalants sont des composés aromatiques polycycliques (par exemple le bromure d'éthidium) qui s'insèrent entre les paires de bases et provoquent des erreurs de copie.

Les séquences d'insertion, les transposons, les phages tempérés et les épisomes s'insèrent dans le génome et inactivent les gènes.

Tous les agents mutagènes ne sont pas décrits et de nombreuses mutations surviennent en l'absence d'agents mutagènes identifiés.

Caractères des mutations bactériennes

Hasard

Les mutations bactériennes ne sont pas spontanées ! Elles sont induites par des agents mutagènes identifiés ou non  (Cf. supra). Cependant, la spontanéité est souvent considérée comme une caractéristique des mutations. Ce terme est impropre ! Il est en fait utilisé pour souligner que les mutations s'effectuent au hasard.
En reprenant les résultats de la manipulation présentée dans le schéma 1, on peut se poser la question suivante : les bactéries résistantes à la streptomycine (agent non mutagène) sont-elles apparues au hasard (indépendamment de la streptomycine) ou l'antibiotique est-il responsable de leur apparition ? En d'autres termes, la présence d'agents tels qu'un antibiotique ou un facteur de croissance ou un bactériophage virulent induisent-ils l'apparition de souches antibiorésistantes ou auxotrophes ou résistantes au pouvoir lytique du phage ?

La non-induction des mutations a été formellement établie en 1943 par le test de fluctuation de Luria et Delbrück, puis en 1952 par le test des cultures par réplique de Lederberg et Lederberg. Seul ce dernier test sera développé ci-dessous. Le lecteur intéressé par l'expérience de Luria et Delbrück pourra consulter la publication originale librement disponible sur Internet (voir http://www.genetics.org/cgi/reprint/28/6/491).

La technique développée par Joshua Lederberg et Esther M. Lederberg (pour la publication originale voir http://jb.asm.org/cgi/reprint/63/3/399.pdf) peut se résumer comme suit (voir schéma 2).
. Un morceau de velours stérile est tendu sur un cylindre de métal ou de bois dont le diamètre est légèrement plus petit que celui d'une boîte de Pétri. En appuyant légèrement le cylindre sur une culture effectuée sur un milieu gélosé, le velours prélève une fraction de chaque colonie ou de la nappe de culture. En appliquant la surface du velours sur une autre gélose vierge, on obtient, d'un seul coup, une réplique de la culture initiale.
. Une culture en bouillon d'une souche de Escherichia coli sensible à la streptomycine est ensemencée sur un milieu gélosé dépourvu d'antibiotique. L'ensemencement est réalisé de telle manière que l'on obtienne, après incubation, une culture en nappe. Une réplique de cette culture est effectuée sur un milieu gélosé identique mais contenant de la streptomycine. Une ou quelques colonies peuvent apparaître sur ce milieu. Cette ou ces colonies sont donc constituées de bactéries résistantes à la streptomycine et provenant de la culture initiale.
. Il est possible de repérer, sur le milieu d'origine, l'endroit correspondant à une colonie résistante. La culture est alors prélevée et ensemencée dans un bouillon sans antibiotique.
Après incubation, on ensemence à nouveau une gélose sans antibiotique avec un inoculum plus faible (par exemple, 10⁶ bactéries) et, après culture, on effectue une réplique sur un milieu avec streptomycine. Le nombre de colonies obtenu sur le milieu avec streptomycine est plus important que précédemment.
. En répétant ce processus plusieurs fois, on obtient des cultures de plus en plus riches en bactéries résistantes à l'antibiotique. Finalement, en n'ensemençant que 100 cellules on obtient, sur le milieu sans antibiotique, des colonies isolées. Cette culture est alors repiquée par la technique du tampon de velours sur une nouvelle boîte contenant de la streptomycine. On repère sur la boîte sans antibiotique l'emplacement correspondant à une colonie résistante et on prélève la colonie située à cet emplacement. La mise en culture de cette colonie donne naissance à une population bactérienne dont toutes les cellules sont résistantes à la streptomycine.

Il est important de noter que les milieux contenant de la streptomycine ne servent qu'à repérer les mutants qu'ils ont sélectionnés. Le fait capital est qu'à chacune des étapes, sans aucun contact direct avec l'antibiotique, le nombre de mutants augmente et on finit par obtenir une population bactérienne dont toutes les cellules résistent à la streptomycine. Ce type d'expérience démontre, sans aucune ambiguïté, que la mutation n'est pas induite par l'agent sélecteur, en l'occurrence la streptomycine. La mutation s'est effectuée au hasard et la streptomycine se contente de sélectionner les mutants résistants.

Fréquence

Les mutations sont des phénomènes rares qui n'affectent qu'un faible pourcentage de cellules au sein d'une population abondante.

Le taux de mutation correspond à la probabilité pour une bactérie de muter pendant une unité de temps définie qui est généralement le temps de génération. Pour une souche, ce taux est caractéristique d'un caractère donné et il varie de 10^-4 à 10^-12. Le taux de mutation moyen est de l'ordre de 10^-6 - 10^-7.

Le taux de mutation ne doit pas être confondu avec le nombre de mutants rencontrés à un instant donné. Le taux de mutation est fixe pour un caractère donné et pour une souche donnée alors que le nombre de mutants peut augmenter ou diminuer en fonction des conditions.
Par exemple, un mutant résistant à un antibiotique peut présenter une croissance altérée par rapport à la souche sauvage et il cultivera moins bien dans un environnement dépourvu d'antibiotique. En revanche, en présence de l'antibiotique, les bactéries de la souche sauvage verront leur croissance diminuer ou elles seront tuées alors que les cellules de la souche mutante continueront à croître.

Discontinuité et stabilité

Une mutation est généralement un phénomène discontinu (loi du tout ou rien). Dans quelques cas, un caractère phénotypique particulier, comme la résistance à haut niveau vis-à-vis de la pénicilline ou du chloramphénicol, résulte de mutations successives. Chaque mutation augmente la résistance et plusieurs mutations sont nécessaires pour entraîner une résistance élevée.

Même, en l'absence de l'agent sélecteur, une mutation est un caractère héréditaire transmis à la descendance (stabilité).
La stabilité n'est pas incompatible avec la réversibilité et il existe des mutations "réverses" ou inverses, aptes à rétablir le phénotype initial. Ainsi, de la même manière qu'il existe des cellules résistantes par mutation dans une population bactérienne sensible à un antibiotique, il existe des cellules sensibles par mutation inverse dans une population bactérienne résistante.
Les mutations "réverses" présentent les mêmes caractères de rareté, de discontinuité et de stabilité.

Spécificité et indépendance

Une mutation n'affecte qu'un seul caractère à l'exclusion de tous les autres (spécificité). Cependant, lorsque la mutation touche un gène d'un opéron, elle peut avoir des répercussions sur plusieurs caractères et on parle de mutation pléiotrope.

La mutation d'un caractère donné ne modifie pas la probabilité de mutation d'un autre caractère et il y a indépendance des mutations. Il en résulte que la probabilité de mutations simultanées vis-à-vis de plusieurs caractères est égale au produit des taux de mutation individuels.
Cette notion est d'une importance capitale dans l'antibiothérapie. Si un germe présente un taux de mutation de 10^-5 pour un antibiotique et de 10^-6 pour un autre antibiotique, la probabilité de voir apparaître un mutant résistant aux deux antibiotiques sera de 10^-11. Éviter l'apparition de mutants résistants est la seule justification réelle d'une association de deux ou de plusieurs antibiotiques.
Un exemple classique est celui du traitement d'une tuberculose pulmonaire chez l'homme. Une caverne évolutive de 2 cm de diamètre peut contenir une population de l'ordre de 10⁸ bacilles tuberculeux. Si le taux mutation est de 10^-5 pour l'isoniazide et de 10^-7 pour la rifampicine, la probabilité d'isoler un double mutant résistant aux deux antibiotiques est de 10^-12. Une telle émergence est évitée par une antibiothérapie associant, au moins deux antituberculeux. Inversement, l'instauration d'une monothérapie par l'isoniazide ou la rifampicine sera suivie de la sélection d'une souche résistante.

Sélection des mutants

Lorsque la mutation favorise la croissance par rapport à la souche sauvage, il est aisé d'isoler les mutants par sélection positive. Par exemple, un mutant résistant à un antibiotique ou à un bactériophage sera isolé par culture en présence de l'antibiotique ou du phage qui inhiberont ou détruiront la souche sauvage.
La sélection de bactéries mutées par insertion de transposons codant pour la résistance à un antibiotique (par exemple, Tn5 codant pour la résistance à la kanamycine ou Tn10 codant pour la résistance à tétracycline) est basée sur le même principe.

L'isolement d'un mutant auxotrophe peut se réaliser par la technique des répliques. La population bactérienne est ensemencée sur un milieu permettant la croissance des bactéries normales et mutées et une réplique de la culture est effectuée sur un milieu ne permettant que la croissance des bactéries normales. Par comparaison des deux cultures il est possible de localiser les colonies constituées de mutants. Cette technique est difficile à utiliser en routine : les mutations s'effectuent à basse fréquence et il n'est pas facile de récupérer des colonies isolées lorsque leur nombre est supérieur 100 par boîte. Aussi, on préfère avoir recours à une sélection négative.
La sélection négative repose sur le fait que certains antibiotiques, comme la pénicilline, ne sont actifs que sur les bactéries en phase de croissance. Par exemple, le protocole pour isoler un mutant auxotrophe pour l'histidine en utilisant de la pénicilline est le suivant :
. Culture dans un milieu minimum liquide dépourvu d'histidine permettant la croissance des bactéries normales, mais inhibant la croissance des bactéries mutées.
. Addition de pénicilline qui détruit les cellules en croissance (bactéries prototrophes aptes à se multiplier), mais qui est sans action sur les bactéries auxotrophes incapables de se multiplier en l'absence d'histidine.
. Centrifugation du milieu, mise en suspension des bactéries dans bouillon dépourvu d'histidine et addition de pénicilline. Cette étape a pour but d'augmenter le nombre d'auxotrophes dans la population bactérienne.
. Ensemencement sur un milieu gélosé contenant de l'histidine (permettant la multiplication des mutants et des bactéries normales) suivi d'une réplique de la culture sur un milieu dépourvu d'histidine. La population bactérienne ayant été enrichie en mutants, la comparaison des deux cultures permet de localiser facilement les colonies constituées de mutants.

Les mutations peuvent être létales lorsqu'elles se produisent dans des gènes essentiels. De tels mutations ne peuvent être sélectionnées par les techniques exposées ci-dessus et leur sélection nécessite le recours à des mutants létaux conditionnels. Généralement il s'agit de mutants thermosensibles, capables d'exprimer le gène muté à une température dite permissive (par exemple 25-30 °C), mais incapables de se multiplier à une température plus élevée de l'ordre de 42 °C. La technique des répliques, utilisant des boîtes incubées à 25-30 °C ou 42 °C, permet de sélectionner de tels mutants.

Conséquences et applications

Utilisation des mutants en recherche

La comparaison des souches sauvages et des souches mutées permet d'établir le rôle d'un locus génétique et des protéines pour lesquelles il code. L'obtention de mutants, incapables de synthétiser une protéine, est souvent un temps essentiel pour impliquer cette protéine dans le pouvoir pathogène ou pour évaluer son rôle physiologique.
Le séquençage complet de plusieurs génomes bactériens est actuellement réalisé. De nombreux cadres de lecture ouverts (orf) codent pour des protéines dont les fonctions sont encore inconnues. L'obtention de mutants spécifiques aidera à comprendre l'importance de ces gènes et de leurs produits.

Importance dans le diagnostic

Les mutants morphologiques (mutants incapables de synthétiser les chaînes polysaccharidiques du LPS et donnant une dissociation S ---> R, mutants incapables de synthétiser une capsule, mutants incapables de sporuler,  mutants incapables de mobilité, etc.), les mutants nutritionnels (mutants auxotrophes pour un ou plusieurs facteurs de croissance) ou les mutants métaboliques (incapables de fermenter un sucre, incapables de dégrader un acide aminé, etc.) sont à prendre en compte dans le diagnostic.

La dissociation S (smooth) --> R (rough), bien connue chez les entérobactéries, se traduit par une modification de l'aspect des colonies. Les colonies S sont lisses, rondes et régulières alors que les colonies R ont un aspect granuleux ou plissé avec un contour irrégulier. Chez les salmonelles, on connaît plusieurs types de mutants : (i) les mutants R dépourvus de chaînes polysaccharidiques mais ayant un core complet, (ii) les mutants R profonds (rough profonds) dépourvus de chaînes polysaccharidiques et possédant un core incomplet et (iii) les mutants semi-rough ayant un core complet mais dont les chaînes polysaccharidiques sont réduites à un seul chaînon.
Les bactéries sous forme R sont fréquemment autoagglutinables en eau physiologique si bien qu'il est impossible de caractériser leur spécificité antigénique O par agglutination avec des anti-sérums spécifiques.
Chez Streptococcus pneumoniae, les mutants non capsulés donnent des colonies comparables aux colonies R des entérobactéries. Aussi, par analogie, on qualifie de S les formes capsulées et de R les formes dépourvues de capsule. Toutefois, contrairement à ce qui est observé chez les entérobactéries, les pneumocoques R ont une paroi normale.

Les mutants R et les mutants dépourvus de capsule ont également une importance en médecine car leur pouvoir pathogène est atténué ou nul. Chez certaines espèces (par exemple les espèces de l'ordre des Spirochaetales), les mutants immobiles ont une virulence diminuée ce qui permet d'impliquer la mobilité dans le pouvoir pathogène.

Importance dans l'antibiothérapie

Les mutants résistants aux antibiotiques sont d'une importance majeure en médecine, même si la résistance par mutation est considérée comme moins importante que la résistance liée à l'acquisition de plasmides, de transposons ou d'intégrons. Voir le chapitre Résistance bactérienne aux antibiotiques.

Importance dans l'industrie

Des souches mutatntes sont utilisées dans l'industrie, notamment pour la production d'acides aminés. Ainsi Corynebacterium glutamicum (qui est un synonyme antérieur de "Brevibacterium flavum" et de "Micrococcus glutamicus") est utilisé pour produire de l'acide glutamique, de l'ornithine et de la lysine. Des souches mutantes ont été obtenues afin de permettre une production par fermentation de ces acides aminés. Ces mutants sont hyperproducteurs d'acides aminés et ils les excrètent dans le milieu extérieur.
Des souches mutantes de Streptomyces rimosus et de Escherichia coli  sont utilisées pour la production d'isoleucine (S. rimosus) ou de phénylalanine (E. coli).

Le test de Ames

Le test de mutagénèse ou Mutatest ou test de Ames constitue la principale application pratique des mutations. L'étude détaillée de ce test dépasse le cadre de ce fichier et il ne sera envisagé que de façon succincte. Le lecteur souhaitant un complément d'information pourra consulter le site Le test d'Ames ou Mutatest in La gazette du laboratoire.

Le test de Ames à pour but de dépister rapidement des substances génotoxiques (voir schéma 3). Il utilise plusieurs souches (généralement quatre souches) de Salmonella Typhimurium auxotrophes pour l'histidine. Chacune des souches porte une mutation spécifique affectant l'un des gènes de l'opéron d'histidine. Ces mutations sont réversibles et une souche auxotrophe pour l'histidine redonne, par mutation inverse, une souche prototrophe. Ces mutations inverses peuvent se produire en l'absence d'agents identifiés ou être induites par des mutagènes. Le test de Ames consiste à évaluer la capacité d'un produit à induire des mutations reverses (obtentions de souches prototrophes) chez des souches de Salmonella Typhimurium auxotrophes pour l'histidine.
De nombreuses substances ne deviennent génotoxiques qu'après bioactivation métabolique. Chez les mammifères, la biotransformation est assurée par des enzymes (notamment des enzymes hépatiques) qui exigent des cofacteurs (oxygène et NADPH). Elle conduit soit à la détoxication et à l'élimination des composés génotoxiques soit à la formation de métabolites plus toxiques que la molécule d'origine.  Dans le Mutatest, cette activation est assurée par le S9 Mix. Le S9 Mix est constitué d'un homogénat de foie de rat (S9) et de cofacteurs tels que le NADPH et le glucose-6-phosphate (Mix). Le prétraitement des animaux avec un inducteur présent dans l'alimentation (généralement  l'Aroclor 1254) assure la présence de tous les systèmes enzymatiques.
Outre les mutations concernant l'utilisation de l'histidine, les souches utilisées possèdent diverses mutations ayant pour but d'augmenter leur perméabilité aux xénobiotiques ou de neutraliser lleur capacité de réparation de l'ADN. Certaines souches possèdent également un plasmide qui augmente les risques d'erreurs au cours de la réparation de l'ADN.

Couramment pratiqué dans le monde entier, le test de Ames est une méthode simple, sensible et précise permettant d'identifier un grand nombre de génotoxiques potentiellement cancérogènes. La validité du test a été vérifiée en déterminant l'activité mutagène de plus de 300 produits chimiques connus pour être ou non cancérogènes chez l'animal. Plus de 90 p. cent des produits  cancérogènes ont donné un test de Ames positif et plus de 90 p. cent des produits non cancérogènes ont donné un test de Ames négatif.
Ce test est utilisé pour des substances chimiques mais aussi pour évaluer la mutagénicité de mélanges complexes tels que des prélèvements d'atmosphère afin d'identifier les mutagènes environnementaux.

Le test de Ames a toutefois des limites :
. Il ne permet pas de détecter les cancérogènes qui ne sont pas génotoxiques.
. Le S9 Mix ne peut pas remplacer toutes les réactions enzymatiques effectuées in vivo.
. Les produits doués d'une activité bactéricide peuvent donner une réponse faussement négative. Inversement, les produits contenant des traces d'histidine peuvent donner une réponse faussement positive.

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